De diagnose botulisme is gebaseerd op de identificatie van het Clostridium botulinum- toxine in het laboratorium en op de observatie van klinische symptomen, zelfs als deze soms niet-specifiek zijn. De ziekte kan in feite worden verward met het Guillain-Barré-syndroom, poliomyelitis, beroerte, myasthenia gravis en tekenverlamming.
In voedselbotulisme zijn het beeld van neuromusculaire aandoeningen en de inname van potentieel besmet voedsel belangrijke aanwijzingen. Gelijktijdige manifestatie bij ten minste 2 patiënten die hetzelfde voedsel aten, vereenvoudigt de diagnose. De bevestiging wordt verkregen door het micro-organisme te isoleren met de kweektest van verdachte voedselmonsters of feces van de patiënt en met de identificatie van botulinumtoxine in voedsel of biologische materialen (zoals bloed, maagsap en braken).
In wond botulisme, aan de andere kant, bevestigt de diagnose van serumtoxine of de isolatie van Clostridium botulinum uit een huidlaesiemonster dit.
